4. 적  요

  칼라의 생장점 유래 캘러스는 multi-shoot 형태로 MS 배지, sucrose 3%, 0.5 mg/L TDZ 배지에서 유지하며 모든 형질전환 실험에 사용하였다. 형질전환체 선발에 사용할 적정 카나마이신 농도의 구명 시험결과, 캘러스의 선발에는 200 mg/L, 식물체로부터 선발 시에는 50∼100mg/L 농도가 적당하였다. 1차 bombardment에서는 pGZaMVCP plasmid를 GA 캘러스와 BM의 생장점에 bombardment 하여 항생제가 없는 배지에서 shoot를 유도 시킨 후 카나마이신 선발 하는 delayed selection을 하였다. 발생한 개체들을 카나마이신 100mg/L 에서 선발한 결과 불과 몇 개체만이 선발 되어 bombardment법을 통한 칼라의 형질전환율이 매우 낮다는 것을 알 수 있었다. 선발 된 개체들을 6% sucrose의 MS 비대배지에서 3개월 이상 배양하였으나 괴경이 완전한 형태로 생성되지도 않았고 shoot도 건강하지 못하였다.

  2차 bombardment 에서는 pCKGFPS65C plasmid를 GA의 캘러스와 기내 발생 생장점에 bombardment하여 항생제가 없는 배지에서 shoot를 유도한 후 activated charcoal, 6% sucrose, MS 비대배지에서 생장시켰다. Activated charcoal은 식물체의 생장은 좋아지나 괴경의 형성에는 크게 좋은 영향을 주지는 않았다. 즉 기내 배양한 유식물체를 비대배지에서 괴경을 유도한 경우 기내에서의 생장도 좋지 않고 괴경도 완전히 형성되지 않았을 뿐더러 순화해도 생존율은 50% 수준에 불과했지만, 뿌리와 shoot만 건강하게 생장시켜 순화 하면 90% 이상의 생존률을 보였고, 토양 순화 4개월 후에는 완전한 괴경이 형성되었다.

  Particle bombardment의 최적조건으로는 개체의 발생률과 생존율에서 1 ㎛, 9 cm, 1100 psi의 조건이 가장 좋았다.

  형질전체체를 35S promoter detection primer로 PCR 한 결과, 1차 bombardment로 pGZaMVCP를 도입한 온실 순화 GA와 2차로 pCKGFPS65C를 도입한 온실 순화 GA 및  3차로 pGZaMVCP를 도입한 기내 GA 그리고 4, 5차 bombardment로 pGZaMVCP를 도입한 BM의 몇 개체에서 350 bp의 PCR 밴드를 확인하였고, pCKGFPS65C를 형질전환시킨 칼라 식물체 중 일부 개체에서 형광단백질(GFP)의 발현을 확인 할 수 있었다.