4. 적 요

<제1세부과제 : 곰취 조직배양 효율증진 기술 개발>

가. N6 염류배지에서 정단조직, 자엽조직의 배양시 여러 가지 생장조정제 단독 및 복합처리에서 완전한 식물체로의 재분화는 이루어지지 않았다.
나. N6 염류배지에 2,4-D, BA, NAA, Kinetin 등의 여러 가지 생장조정제를 단독 및 복합처리한 엽병 조직을 소독하여 치상하였을 때, 2,4-D 1.5ppm 처리와 2,4-D 2ppm + Kinetin 2ppm 처리에서 신초 및 뿌리가 발생하여 완전한 식물체를 얻을 수 있었으나, 캘러스의 재분화 효율이 낮아, 재분화 효율을 높일 필요가 있었다.
다. 엽병 조직으로부터 유래한 캘러스의 재분화 효율이 낮아서, 이를 높이고자 1/2N6 염류에 1/2 자당을 포함한 배지에 캘러스를 재분화시켰을 때, 신초 및 뿌리가 모두 발생한 처리는 2,4-D 1.5ppm + NAA 1.5ppm 처리, 2,4-D 1ppm + Kinetin 2ppm 처리, 2,4-D 2ppm + Kinetin 5ppm 처리였다.

<제2세부과제 : 곰취 유용 유전자 마커 개발>

가. 곰취속 식물들의 유전적 특성을 분석하여 SSR primer set를 개발하기 위하여 NCBI, Pubmed, Google scholar 등에서 제공하는 생물정보학적 툴을 활용하여 곰취속 식물들로부터 개발되어진 SSR 분자마커 또는 해독된 게놈 염기서열정보들을 120건을 동정하였으며 이들로부터 SSR 분자마커의 PCR 증폭이 가능한 primer pair를 작성하였다.
그 결과 14개로 구성된 곰취속 식물 게놈 증폭용 SSR primer set을 최종 완료하였다.
나. PCR 결과 agarose gel에서 DNA 산물의 증폭이 확인된 primer 수는 6조합 (Lho29, Lho37, Lho40, Lho64, Lho77, 그리고 Lho114)이었으며 6조합 모두 agarose gel 상에서는 다형성이 관찰되지 않았다.
다. 전기영동 결과 6조합 모두에서 다형성을 형성하는 것을 확인 할 수 있었다. 이들을 추가적인 프라이머를 선발하여 분석하면 곰취속 식물들의 유전적 평가에 매우 유용하게 활용되어 질 수 있을 것으로 기대되었다.
라. ISSR 분석을 위한 primer는 100개로 구성된 UBC #801∼#900 primer set을 사용하였으며, SSR 분석에 사용되었던 동일한 식물 게놈 DNA를 재료로 PCR 분석을 수행하였다. 1차로 20개 primer pair를 임의로 선발하여 PCR screening에 사용하였다. 최종 PCR 산물들은 1.2% agarose gel에 전기영동 하여 DNA 단편들의 증폭 여부를 확인하였다. PCR 결과 ISSR primer 834번 primer는 자생종, 유사종 및 육성종 식물체들의 구분이 가능하였으며, 3차례 이상의 반복 실험으로 그 재현성이 확인되었다.
마. DNA barcoding primer 제작은 Pubmed에서 선행 연구논문들을 검색, 현재 식물에서 사용되는 DNA barcoding primer를 확보하였으며 이들 중 핵 DNA의 ITS 지역과 색소체 rbcLa, matK, trnH-pbsA 지역을 증폭하기 위한 primer set을 최종 선발하였다.
다양한 곰취속 식물을 대상으로 primer를 사용하여 PCR 분석을 수행한 결과 4개의 DNA 바코딩 지역 모두 단일밴드가 성공적으로 증폭되는 것을 확인하였다. 곰취속 식물들로부터 증폭되어진 4개(ITS, matK, rbcLa 및 trnH-pbsA)의 DNA 바코딩 지역 PCR 산물들은 염기서열 결정을 위해 pGEM T-EASY vector에 클로닝 하였다.
바. 4개의 식물 바코딩 지역(ITS, matK, rbcLa, 그리고 trnH-psbA)의 염기서열 결정을 완료하였다. 그 결과 ITS 지역은 902bp, matK 지역은 1259bp, rbcLa 지역은 602bp, trnH-psbA 지역은 530bp의 염기서열을 가지고 있음을 확인하였다. 곰취속 식물 판별을 위한 SNP 분자마커 개발을 위하여 유전자별로 확보된 concensus 염기서열을 MAFFT와 Box shade 프로그램을 사용하여 다중 염기서열 정렬 분석을 수행하였다.
ITS 지역은 곰취속 식물들의 판별이 가능한 다수의 SNPs가 존재하고 있음이 확인되었다. 특히 종간(예, 곰취와 곤달비) 구분이 가능한 SNP 뿐만 아니라 종내(곰취 단일종) 수집지 별 판별이 가능한 SNPs 또한 존재하고 있음이 확인되었다. matK 지역은 곰취와 곤달비의 구분이 가능한 3개의 SNPs가 존재함이 확인되었다. trnH-psbA 지역은 곰취와 곤달비의 구분이 가능한 2개의 SNPs가 존재함이 확인되었다.
사. 곰취속 식물들의 판별을 위하여 개발된 종간 또는 종내 특이 SNPs 서열을 바탕으로 PCR 증폭용 프라이머를 제작하였다. trnH-psbA 지역에 존재하는 종 특이 SNPs의 경우 AT rich 지역 내에 존재하는 이유로 인해 PCR 증폭을 위한 프라이머 제작이 불가능하였으며 ITS 지역 및 matK 지역에 존재하는 SNPs 들은 성공적으로 allele-specific 프라이머의 제작이 완료되었다. 제작된 allele-specific 프라이머를 사용하여 PCR 분석을 수행 중에 있으며 이들 중 matK 지역에 존재하는 첫 번째 SNP를 토대로 제작된 두 개의 프라이머의 PCR 분석결과 곰취와 곤달비의 구분이 가능함이 검증되었다.